Madu mürk sisaldab ensüüme, mis hüdrolüüsivad karboksüülestersidemeid.Hüdrolüüsi substraadid on fosfolipiidid, atsetüülkoliin ja aromaatne atsetaat.Need ensüümid hõlmavad kolme tüüpi: fosfolipaas, atsetüülkoliinesteraas ja aromaatne esteraas.Madu mürgis sisalduv arginiini esteraas võib hüdrolüüsida ka sünteetilist arginiini või lüsiini, kuid peamiselt hüdrolüüsib looduses valgu peptiidsidemeid, seega kuulub ta proteaasi hulka.Siin käsitletavad ensüümid toimivad ainult estri substraatidele ja ei saa toimida ühelegi peptiidsidemele.Nende ensüümide hulgas on atsetüülkoliinesteraasi ja fosfolipaasi bioloogilised funktsioonid olulisemad ja neid on täielikult uuritud.Mõnedel maomürkidel on tugev aromaatse esteraasi aktiivsus, mis võib hüdrolüüsida p-nitrofenüületüülestrit, a- või P-naftaleenatsetaati ja indooli etüülestrit.Siiani pole teada, kas selle aktiivsuse põhjustab sõltumatu ensüüm või karboksüülesteraasi teadaolev kõrvalmõju, rääkimata selle bioloogilisest tähtsusest.Kui Agkistrodon halys Japonicus'e mürk pandi reageerima p-nitrofenüületüülestri ja indooletüülestriga, siis p-nitrofenooli ja indoolfenooli hüdrolüsaate ei leitud;Vastupidi, kui need estrid reageerivad kobra Zhoushani alamliikide madude mürgiga ja Bungarus multicinctus maomürgiga, hüdrolüüsitakse need kiiresti.On teada, et neil kobra mürkidel on tugev koliinesteraasi aktiivsus, mis võib olla vastutav ülalnimetatud substraatide hüdrolüüsi eest.Tegelikult Mclean et al.(1971) teatasid, et paljud Cobra perekonda kuuluvad maomürgid võivad hüdrolüüsida indooli etüülestrit, naftaleenetüülestrit ja butüülnaftaleeni estrit.Need maomürgid pärinevad: kobrast, musta kaelaga kobrast, musta huulega kobrast, kuldsest kobrast, egiptuse kobrast, kuningkobrast, kuldkobra mambast, mustast mambast ja valge huulega mambast (D. aw tunneb ikka veel idapoolset romboolmambat
Madu mürk võib hüdrolüüsida metüülindooli etüülestrit, mis on substraat koliinesteraasi aktiivsuse määramisel seerumis, kuid see maomürk ei näita koliinesteraasi aktiivsust.See näitab, et kobra mürgis on tundmatu esteraas, mis erineb koliinesteraasist.Selle ensüümi olemuse mõistmiseks on vaja täiendavat eraldamistööd.
1, fosfolipaas A2
(I) Ülevaade
Fosfolipaas on ensüüm, mis suudab hüdrolüüsida glütserüülfosfaati.Looduses on 5 tüüpi fosfolipaase, nimelt fosfolipaas A2 ja fosfolipaas
A. , fosfolipaas B, fosfolipaas C ja fosfolipaas D. Madu mürk sisaldab peamiselt fosfolipaas A2 (PLA2), mõned maomürgid sisaldavad fosfolipaas B ja teisi fosfolipaase leidub peamiselt loomsetes kudedes ja bakterites.Joonisel 3-11-4 on näidatud nende fosfolipaaside toimekoht substraadi hüdrolüüsil.
Fosfolipaasidest on rohkem uuritud PLA2.See võib olla enim uuritud ensüüm madu mürgis.Selle substraadiks on esterside Sn-3-glütserofosfaadi teisel positsioonil.Seda ensüümi leidub laialdaselt maomürgis, mesilasmürgis, skorpioni mürgis ja loomsetes kudedes ning PLA2 leidub rohkesti neljas perekonna maomürgis.Kuna see ensüüm lõhub punaseid vereliblesid ja põhjustab hemolüüsi, nimetatakse seda ka "hemolüsiiniks".Mõned inimesed kutsuvad PLA2 ka hemolüütiliseks letsitinaasiks.
Ludeeke leidis esmakordselt, et maomürk võib ensüümide kaudu letsitiinile mõjudes toota hemolüütilist ühendit.Hiljem on Delezenne et al.tõestas, et kui kobra mürk mõjutab hobuse seerumit või munakollast, moodustab see hemolüütilise aine.Nüüdseks on teada, et PLA2 võib otseselt mõjuda erütrotsüütide membraani fosfolipiididele, hävitades erütrotsüütide membraani struktuuri ja põhjustades otsest hemolüüsi;See võib toimida ka seerumile või lisatud letsitiinile, tekitades hemolüütilise letsitiini, mis mõjutab punaseid vereliblesid, põhjustades kaudset hemolüüsi.Kuigi PLA2 leidub rohkesti neljas maomürkide perekonnas, on ensüümide sisaldus erinevates maomürkides veidi erinev.Lõgismadu (C
Madu mürk näitas ainult nõrka PLA2 aktiivsust.Tabel 3-11-11 illustreerib PLA2 aktiivsuse võrdlust 10 peamise mürgise madude mürgi puhul Hiinas.
Tabel 3-11-11 10 maomürgi fosfolipaasi VIII aktiivsuse võrdlus Hiinas
Madu mürk
Rasva vabanemine
alifaatne hape,
Cjumol/mg)
Hemolüütiline aktiivsus CHU50/^ g * ml)
Madu mürk
Vabastage rasvhapped
(^raol/mg)
Hemolüütiline aktiivsus (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
üksteist
Mikratsefaalpõletik
viis koma üks null
kalyspallas
8. 68
kaks tuhat kaheksasada
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
kolm koma kaheksa kaks
sada nelikümmend
Bnugarus fasctatus
7,56
kakssada kaheksakümmend
B. multicinctus
üks punkt üheksa kuus
kakssada kaheksakümmend
Rästik ja russelli
seitse koma null kolm
T, mucrosquamatus
üks punkt kaheksa viis
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Eraldamine ja puhastamine
PLA2 sisaldus maomürgis on suur ning see on kuumuse, happe, leelise ja denaturaatori suhtes stabiilne, nii et seda on lihtne puhastada ja eraldada PLA2.Levinud meetod on esmalt teostada toormürgil geelfiltreerimine, seejärel teostada ioonvahetuskromatograafia ja järgmist sammu saab korrata.Tuleb märkida, et PLA2 külmkuivatamine pärast ioonivahetuskromatograafiat ei tohiks põhjustada agregatsiooni, sest külmkuivatusprotsess suurendab sageli süsteemi ioontugevust, mis on oluline PLA2 agregatsiooni põhjustav tegur.Lisaks ülaltoodud üldistele meetoditele on kasutusele võetud ka järgmised meetodid: ① Wells et al.② PLA2 substraadi analoogi kasutati ligandina afiinsuskromatograafias.See ligand võib Ca2+-ga seonduda maomürgis sisalduva PLA2-ga.Eluendina kasutatakse enamasti EDTA-d.Pärast Ca2+ eemaldamist väheneb afiinsus PLA2 ja ligandi vahel ning seda saab ligandist dissotsieerida.Teised kasutavad eluendina 30% orgaanilist lahust või 6 mol/l uureat.③ Hüdrofoobne kromatograafia viidi läbi PheiiylSephar0SeCL-4B-ga, et eemaldada PLA2 jälg kardiotoksiinist.④ PLA2 afiinsuskromatograafia läbiviimiseks kasutati ligandina PLA2-vastast antikeha.
Siiani on puhastatud suur hulk maomürki PLAZ.Tu et al.(1977) loetlesid enne 1975. aastat mao mürgist puhastatud PLA2. Viimastel aastatel on igal aastal avaldatud palju artikleid PLA2 eraldamise ja puhastamise kohta.Siin keskendume Hiina teadlaste PLA eraldamisele ja puhastamisele.
Chen Yuancong et al.(1981) eraldasid Zhejiangis asuva Agkistrodon halys Pallas mürgist kolm PLA2 liiki, mida saab nende isoelektriliste punktide järgi jagada happeliseks, neutraalseks ja aluseliseks PLA2-ks.Oma toksilisuse järgi on mürgisem neutraalne PLA2, mis on identifitseeritud kui presünaptiline neurotoksiin Agkistrodotoksiin.Leeliseline PLA2 on vähem toksiline ja happeline PLA2 peaaegu puudub.Wu Xiangfu jt.(1984) võrdlesid kolme PLA2 omadusi, sealhulgas molekulmassi, aminohappe koostist, N-terminali, isoelektrilist punkti, termilist stabiilsust, ensüümi aktiivsust, toksilisust ja hemolüütilist aktiivsust.Tulemused näitasid, et neil oli sarnane molekulmass ja termiline stabiilsus, kuid neil oli olulisi erinevusi muudes aspektides.Ensüümide aktiivsuse aspektist oli happelise ensüümi aktiivsus kõrgem kui aluselise ensüümi aktiivsus;Aluselise ensüümi hemolüütiline toime roti punastele verelibledele oli tugevaim, sellele järgnes neutraalne ensüüm ja happeline ensüüm oli peaaegu hemolüüsitud.Seetõttu oletatakse, et PLAZ-i hemolüütiline toime on seotud PLA2 molekuli laenguga.Zhang Jingkang jt.(1981) on valmistanud Agkistrodotoksiini kristalle.Tu Guangliang jt.(1983) teatasid, et mürgine PLA isoelektrilise punktiga 7,6 eraldati ja puhastati Fujianist pärit Vipera rotunduse mürgist ning selle füüsikalistest ja keemilistest omadustest, aminohappe koostisest ja 22 aminohappejäägi järjestusest N-s. -terminal määrati.Li Yuesheng jt.(1985) eraldasid ja puhastasid Fujianis Viper rotunduse mürgist teise PLA2.PLA2* subühik on 13 800, isoelektriline punkt 10,4 ja eriaktiivsus 35/xnioI/miri mg. Letsitiini substraadina on ensüümi optimaalne pH 8,0 ja optimaalne temperatuur 65 °C. LD5 süstiti intravenoosselt hiirtele.See on 0,5 ± 0,12 mg/kg.Sellel ensüümil on ilmne antikoagulantne ja hemolüütiline toime.Mürgine PLA2 molekul koosneb 18 erineva aminohappe 123 jäägist.Molekul on rikas tsüsteiini (14), asparagiinhappe (14) ja glütsiini (12) poolest, kuid sisaldab ainult ühte metioniini ja selle N-ots on seriinijääk.Võrreldes Tuguangi eraldatud PLA2-ga on kahe isoensüümi molekulmass ja aminohappejääkide arv väga sarnased ning ka aminohapete koostis on väga sarnane, kuid asparagiinhappe ja proliini jääkide arv on mõnevõrra erinev.Guangxi kuningkobra madude mürk sisaldab rikkalikku PLA2-d.Shu Yuyan et al.(1989) eraldasid mürgist PLA2, mille spetsiifiline aktiivsus on 3,6 korda suurem kui algsel mürgil, molekulmass 13000, koostis 122 aminohappejäägist, isoelektriline punkt 8,9 ja hea termiline stabiilsus.Elektronmikroskoobiga vaadeldes aluselise PLA2 mõju punastele verelibledele on näha, et sellel on ilmne mõju inimese punaste vereliblede membraanile, kuid see ei avalda ilmset mõju kitse punalibledele.Sellel PLA2-l on inimeste, kitsede, küülikute ja merisigade punaste vereliblede elektroforeesi kiirusele ilmne pidurdav toime.Chen et al.See ensüüm võib pärssida ADP, kollageeni ja naatriumarahhidoonhappe poolt indutseeritud trombotsüütide agregatsiooni.Kui PLA2 kontsentratsioon on 10/xg/ml~10 kannu/ml, on trombotsüütide agregatsioon täielikult inhibeeritud.Kui materjalidena kasutati pestud trombotsüüte, ei suutnud PLA2 inhibeerida agregatsiooni kontsentratsioonil 20Mg/ml.Aspiriin on tsüklooksügenaasi inhibiitor, mis võib pärssida PLA2 toimet trombotsüütidele.PLA2 võib inhibeerida trombotsüütide agregatsiooni, hüdrolüüsides arahhidoonhapet tromboksaan A2 sünteesiks.Agkistrodon halys Pallas mürgi poolt Zhejiangi provintsis toodetud PLA2 lahuse konformatsiooni uuriti ringdikroismi, fluorestsentsi ja UV-kiirguse neeldumise abil.Katsetulemused näitasid, et selle ensüümi põhiahela konformatsioon oli sarnane teiste liikide ja perekondadest pärit sama tüüpi ensüümi omaga, skeleti konformatsioon oli hea kuumakindlusega ja happelise keskkonna struktuurne muutus oli pöörduv.Aktivaatori Ca2+ ja ensüümi kombinatsioon ei mõjuta trüptofaani jääkide keskkonda, inhibiitor Zn2+ aga vastupidi.Viis, kuidas lahuse pH väärtus mõjutab ensüümi aktiivsust, erineb ülaltoodud reagentidest.
Madu mürgi PLA2 puhastamise protsessis on ilmne nähtus, et maomürk sisaldab kahte või enamat PLA2 elueerimise piiki.Seda nähtust saab seletada järgmiselt: ① isoensüümide olemasolu tõttu;② Ühte tüüpi PLA2 polümeriseeritakse mitmesugusteks erineva molekulmassiga PLA2 segudeks, millest enamik on vahemikus 9 000–40 000;③ PLA2 ja teiste maomürgi komponentide kombinatsioon muudab PLA2 keeruliseks;④ Kuna PLA2 amiidside on hüdrolüüsitud, muutub laeng.① ja ② on tavalised, välja arvatud mõned erandid, näiteks PLA2 CrWa/w maomürgis
On kaks olukorda: ① ja ②.Kolmas haigusseisund on leitud PLA2-st järgmiste madude mürgis: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestiina rästik, liivarästik ja kohutav lõgismadu km.
Juhtumi ④ tulemus muudab PLA2 migratsioonikiirust elektroforeesi ajal, kuid aminohapete koostis ei muutu.Peptiide saab hüdrolüüsiga purustada, kuid üldiselt seotakse need siiski disulfiidsidemetega.Idakaevu lõgismao mürk sisaldab kahte PLA2 vormi, mida nimetatakse vastavalt tüübiks a ja tüübiks p PLA2.Nende kahe PLA2 tüübi erinevus seisneb ainult ühes aminohappes, see tähendab, et glutamiin ühes PLA2 molekulis on asendatud glutamiinhappega teises PLA2 molekulis.Kuigi selle erinevuse täpne põhjus pole selge, arvatakse üldiselt, et see on seotud PLA2 deaminatsiooniga.Kui Palestiina rästikumürgis sisalduv PLA2 hoida koos toormürgiga soojas, muutub selle ensüümi molekulide lõpprühmi varasemast rohkem.C-st pärit mao mürgist eraldatud PLA2-l on kaks erinevat N-otsa ja selle molekulmass on 30 000. Selle nähtuse põhjuseks võib olla PLA2 asümmeetriline dimeer, mis sarnaneb sümmeetrilise dimeeriga, mille PLA2 moodustab ida-teemantselja lõgismao mürgis ja lääne teemantselga lõgismadu.Aasia kobra koosneb paljudest alamliikidest, millest mõned ei ole klassifikatsioonis väga kindlad.Näiteks tuntakse nüüd ära see, mida varem nimetati Cobra Välis-Kaspia alamliigiks
Seda tuleks omistada Välis-Kaspia mere kobrale.Kuna alamliike on palju ja need on omavahel segatud, on maomürgi koostis erinevatest allikatest tulenevalt väga erinev, samuti on kõrge PLA2 isosüümide sisaldus.Näiteks kobra mürk
Kobra alamliigi Kaspia mürgis leiti vähemalt 9 tüüpi r ^ ll liikide PLA2 isoensüüme ja 7 tüüpi PLA2 isosüüme.Durkin et al.(1981) uurisid PLA2 sisaldust ja isosüümide arvu erinevates maomürkides, sealhulgas 18 kobra mürgis, 3 mamba mürgis, 5 rästikumürgis, 16 lõgismadu mürgis ja 3 meremadu mürgis.Üldiselt on kobra mürgi PLA2 aktiivsus kõrge, palju isoensüüme.Rästikumürgi PLA2 aktiivsus ja isoensüümid on keskmised.Mamba mürgi ja lõgismadu mürgi PLA2 aktiivsus on väga madal või puudub üldse PLA2 aktiivsus.Ka meremadude mürgi PLA2 aktiivsus on madal.
Viimastel aastatel ei ole teatatud, et maomürgis sisalduv PLA2 eksisteeriks aktiivse dimeerina, näiteks idapoolse rombofora lõgismadu kujul (C. madu mürk sisaldab tüüpi a ja PLA2, mis mõlemad koosnevad kahest identsest alaühikust , ja ainult dimeraasil on
Tegevus.Shen et al.tegi ka ettepaneku, et ensüümi aktiivne vorm on ainult maomürgi PLA2 dimeer.Ruumilise struktuuri uurimine tõestab ka, et lääne teemantselja lõgismao PLA2 eksisteerib dimeeri kujul.Kalasööja ühend
Madu mürgil on kaks erinevat PLA ^ Ei ja E2, milles 仏 eksisteerib dimeeri kujul, dimeer on aktiivne ja selle dissotsieerunud monomeer on inaktiivne.Lu Yinghua et al.(1980) uurisid täiendavalt E. Jayanthi jt füüsikalisi ja keemilisi omadusi ning reaktsioonikineetikat.(1989) eraldasid rästiku mürgist aluselise PLA2 (VRVPL-V).Monomeeri PLA2 molekulmass on 10000, millel on surmav, antikoagulant ja tursed.Ensüüm suudab polümeriseerida erineva molekulmassiga polümeere PH 4,8 tingimustes ning temperatuuri tõustes suureneb polümeeride polümerisatsiooniaste ja molekulmass.96 °C juures tekkiva polümeeri molekulmass on 53 100 ja selle polümeeri PLA2 aktiivsus suureneb kahe võrra.
Postitusaeg: 18.11.2022